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ARCHIVOS DE OFTALMOLOGIA DE BUENOS AIRES
VOLUMEN 81 NÚMERO 01 - Enero-Marzo 2010
ARCH. OFTAL. B. AIRES; vol 81 nº 01; pág 09-16; 2010

Prevención del Desarrollo de Gliosis y Angiogénesis Mediante Hipotermia en un Modelo Experimental de Retinopatía Proliferativa Isquémica en Ratas

Manuel Rey-Funes (1), Verónica B. Dorfman (2), Mariano E. Ibarra (1),
C. Fabián Loidl (1)

(1) Laboratorio de Neuropatología Experimental, Instituto de Biología Celular y Neurociencia “Prof. E. De Robertis”, Facultad de  Medicina. Universidad de Buenos Aires, Argentina.
(2) Centro de Estudios Biomédicos, Biotecnológicos, Ambientales y Diagnóstico (CEBBAD), Universidad Maimónides, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.

Autor responsable: Manuel Rey-Funes
E-mail: manuel.reyfunes@gmail.com

RESUMEN

Objetivo: Evaluar la hipotermia como tratamiento en la retinopatía proliferativa isquémica en un modelo experimental en ratas.
Métodos: Utilizamos ratas con asfixia prenatal provocada (AP) sometidas o no a hipotermia (HIP). La adrenomedulina (AM) se estudió por inmunohistoquímica (IHQ) y Western-Blot (WB), la gliosis fue evaluada por IHQ para GFAP. La microglía y el número de vasos se analizaron por medio de lecitina.
Resultados: La AM aumenta a los 15 días en AP vs CTL, específicamente en células de Müller y retina interna. Se observó un aumento significativo del grosor de la retina interna desde los 15 días de edad. El número de vasos de la retina interna aumentó significativamente en AP vs CTL. Se observó gliosis con inmunomarcación de GFAP en la limitante interna y glía perivascular desde los 15 días, y un aumento en el número de la microglía desde los 15 días de edad y en función del tiempo. No se evidenciaron alteraciones en HIP.
Conclusiones: La hipotermia previene la angiogénesis y astrogliosis, demostrando su efecto protector como estrategia contra el daño hipóxico-isquémico en las retinopatías proliferativas. 
Palabras claves: retina, angiogénesis, gliosis, hipotermia, retinopatía del prematuro, retinopatía proliferativa isquémica, asfixia perinatal.

ABSTRACT
Purpose: To evaluate hypothermia as preventive therapy in an experimental model of ischemic proliferative retinopathy in rats.
Methods: Preborn rats, were exposed asphyxia (PA) with (HYP) and without hypothermia (CTL). The expression of adrenomedullin (AM) was studied using immunohistochemistry (IHQ) and Western-Blot (WB). Gliosis was evaluated by IHQ with GFAP-antibody staining. Lectin histochemistry was used to identify microglia and number of blood vessels.
Results: Compared with CTL, PA group showed an increase of AM at 15 days in Müller cells and inner retina, together with a significant enlargement of the inner retina thickness. PA also showed a significant increase in the number of vessels. Gliosis beneath the inner limitant membrane and perivascular locations was evident from day 15 after born. No evidence of alterations was observed animal treated with HYP.
Conclusions: Hypothermia prevents neovascularization and gliosis development in rats, demonstrating its potent protector effect as a strategy against hypoxic-ischemic damage in proliferative retinopathy.
Key words: retina, angiogenesis, gliosis, hypothermia, retinopathy of prematurity, ischemic proliferative retinopathy, perinatal asphyxia.


INTRODUCCIÓN

La asfixia perinatal es un problema grave en servicios de perinatología.1-2  Esta enfermedad afecta a 4 millones de recién nacidos en todo el mundo cada año. Según las estadísticas, un tercio de los afectados sufre lesiones neurológicas, incluyendo distintos grados de retinopatía proliferativa isquémica (IPR).3-4 Además, la asfixia perinatal es un problema aún peor en los países subdesarrollados, debido a los altos costos de los tratamientos establecidos.5 El 90% de los casos de asfixia perinatal ocurren durante el período perinatal, debido entre otras a anomalías como la compresión del cordón umbilical, maniobras obstétricas desfavorables, desprendimiento de placenta, placenta previa, hemorragia o anemia materna, toxemia grávida e infarto placentario. Por esta razón, resulta sumamente clara la importancia de estudiar la prevención de la evolución de las patologías oftalmológicas en los recién nacidos teniendo en cuenta que la retinopatía del prematuro (ROP) es la principal causa de ceguera evitable en niños.6-8
La intensidad y duración de la asfixia perinatal son hechos determinantes para el desarrollo de secuelas tales como alteraciones visuales y auditivas, trastorno de atención e hiperactividad -ADH-,9 epilepsia, retraso mental y parálisis cerebral o espasticidad.4-10 Cuando es severa, la asfixia perinatal genera un estado de hipoxia-isquemia global, que daña el sistema nervioso central (SNC). Las capas internas de la retina (capa nuclear interna, capa plexiforme interna, capa de células ganglionares, capa óptica de fibra nerviosa y capa limitante interna) parecen ser particularmente sensibles a las variaciones en los niveles de oxígeno,11 que provocan distintos grados de retinopatía, pudiendo generar ceguera.
Los recién nacidos prematuros expuestos a hiperoxia durante los cuidados neonatales intensivos son altamente susceptibles a desarrollar ROP.12 Se han descripto dos fases fisiopatológicas para la ROP: (1) daño oxidativo del endotelio vascular y bloqueo en la formación vascular que genera una zona avascular en la retina periférica, y (2) el desarrollo de angiogénesis estimulada por el aumento de la síntesis de factor de crecimiento vascular endotelial y otros factores proangiogénicos, y daño tisular en la retina inmadura como resultado de la reperfusión sanguínea que desencadena la producción exacerbada de radicales libres de oxígeno.12-16
Resultados de nuestro laboratorio han demostrado que la histopatología de la retina en ratas sometidas a un modelo experimental de asfixia perinatal  es compatible con las descripciones de retinopatía proliferativa isquémica (IPR) que se observan en enfermedades como ROP, retinopatía en Diabetes Mellitus y oclusión venosa de la retina.17 Los animales expuestos a asfixia perinatal desarrollan lesiones retinianas cuya morfología es compatible con la ROP, incluyendo degeneración de las células ganglionares, neovascularización de la retina interna (IR: capa limitante interna, capa fibrilar y células ganglionares), y respuesta astroglial con hipertrofia de las células de Müller.16
Por otra parte, estudios en animales, realizados por nuestro y otros laboratorios, han demostrado que la reducción de la temperatura corporal protege al sistema nervioso contra los daños, disminuyendo el metabolismo del tejido nervioso por reducción de especies reactivas del oxígeno e inhibiendo la liberación tóxica de óxido nítrico (NO).18-22 La hipotermia durante la asfixia perinatal ensayada en un modelo animal presenta efectos preventivos contra el daño del SNC en comparación con asfixia perinatal en condiciones normotérmicas.18-20, 22-23 De acuerdo con publicaciones de nuestro laboratorio, cuando la asfixia perinatal es inducida a baja temperatura (15ºC) no se observa mortalidad.22,24 El uso de la hipotermia se ha propuesto como tratamiento neuroprotector para reducir el daño neuronal secundario después de la isquemia hipoxia perinatal severa en humanos.20,23,25 Recientemente se ha realizado un protocolo de investigación clínica de enfriamiento selectivo de la cabeza (10ºC), además de la hipotermia sistémica leve (34,5ºC - 35ºC) en recién nacidos a término con encefalopatía hipóxico-isquémica con resultados alentadores.26
Considerando que previamente hemos demostrado la presencia de vasos de neoformación en las capas más internas de la retina en animales de 60 días que habían sido sometidos a asfixia perinatal,16 el objetivo del presente trabajo ha sido determinar mediante una curva de tiempo el momento en que se manifiesta este aumento en la vascularización así como también la expresión de la hormona peptídica de acción vasodilatadora y estimuladora de angiogénesis adrenomedulina (AM),27-28 y la gliosis en función del tiempo. Hemos complementado este estudio evaluando el efecto de la hipotermia como tratamiento preventivo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Modelo experimental de asfixia perinatal
Se utilizaron ratas preñadas en el último día de gestación (21 días). Las mismas fueron anestesiadas con hidrato de cloral 28% P/V (0.1 ml/100 g/peso) y rápidamente histerectomizadas. Posteriormente, los fetos aún contenidos dentro del útero extirpado, se sumergieron durante 20 minutos en agua a 37°C o a 15ºC. Una vez cumplidos los veinte minutos los fetos fueron extraidos del útero, secados de sus fluidos y estimulados manualmente a respirar. Luego se procedió a ligar el cordón umbilical y se observaron a los animales durante los 80 minutos posteriores al alumbramiento. Los sobrevivientes se colocaron con una rata madre sustituta, que haya tenido cría normalmente el mismo día, reemplazando parte de sus recién nacidos por los experimentales asfícticos previamente identificados. Se consideraron animales experimentales únicamente aquellos que cumplieron con los siguientes parámetros: 1) longitud occipitocaudal > 41 mm, 2) peso > 5 g. Se utilizaron como control aquellos animales nacidos por parto natural. De esta manera quedaron conformados tres grupos experimentales: Controles (CTL), asfícticos a 37ºC (AP) y asfícticos a 15ºC (HIP). Para todos los enfoques experimentales se estudiaron animales de los 3 grupos experimentales de 7, 15, 21 y 30 días de edad.
El modelo animal utilizado ha sido aprobado por Comités de Ética para el manejo de animales de experimentación del país y del extranjero: por UBA (CICUAL), Buenos Aires, Argentina; y por el del Karolinska Institutet, Estocolmo, Suecia y por el del Akademisch Ziekenhuis Maastricht (AzM), Maastricht, Países Bajos.

Microscopía
Los animales fueron anestesiados con hidrato de cloral 28% P/V (0.1ml/100g/peso) por vía intraperitoneal y fijados por perfusión intracardíaca con paraformaldehído al 4% en buffer fosfato 0,1M pH 7,4. Se obtuvieron las retinas para postfijación durante 2 horas. Posteriormente los especímenes fueron crioprotegidos y congelados a -60ºC para su preservación y posterior corte en secciones de 15 µm con criostato. Las secciones obtenidas con el crióstato se montaron en portaobjetos previamente gelatinizados y se les ensayó histoquímica de la lecitina de tomate (Sigma).
Otras secciones se montaron en portaobjetos previamente gelatinados y se les ensayaron técnicas de inmunohistoqúmicas clásicas y revelado con diaminobenzidina para IHQ y anticuerpos secundarios marcados con fluorocromo para inmunofluorescencia (IFi). Se utilizaron anticuerpos primarios contra los siguientes antígenos: AM (anticuerpos procesados en el Laboratorio del Dr. José Rodrigo, Instituto Cajal, España) y GFAP (Sigma). La inmunofluorescencia múltiple fue seguida de análisis con microscopio confocal.

Western-Blot
Los animales fueron anestesiados con una dosis letal de hidrato de cloral. Se extrajeron las retinas enucleando previamente el globo ocular. Se homogeneizaron en buffer RIPA con agregado de inhibidores de proteasas y se centrifugará 30 minutos a 15,000 rpm. Se guardó el sobrenadante a -70ºC para estudio de proteínas celulares totales. Mediante la técnica de Bradford se determinó la concentración de proteínas. Las proteínas se separaron electroforéticamente en geles de acrilamida-bisacrilamida al 10%. Todas las calles del gel fueron cargadas con la misma cantidad de proteínas verificándose posteriormente con anticuerpo anti α-actina. Las proteínas fueron transferidas electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa que se bloqueó con leche descremada e incubó toda la noche con los anticuerpos primarios dirigidos contra AM. Luego se incubó con anticuerpo secundario unido a HRP (Sigma) para ser revelado por quimioluminiscencia (ECL Western Blotting Detection System, Amersham).

Análisis de imágenes y estadística
Las imágenes obtenidas por microscopía óptica,  así como las bandas de proteínas obtenidas en los Western Blots, fueron analizadas mediante un programa de análisis por imágenes computarizado (Scion Image). Se determinaron la densidad óptica relativa (DOR) y el espesor de la IR (retina interna: capas limitante interna, fibras del nervio óptico y de células ganglionares). Se realizaron conteos de vasos y células lectina de tomate por secciones de retina de 400 µm de largo. Todas las determinaciones fueron evaluadas por análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguidos de test de Fisher. Las diferencias fueron consideradas significativas cuando el valor de p < 0,05.

RESULTADOS

Aumento de AM en AP y reversión por hipotermia
Mediante la técnica de Western-Blot se determinó aumento de la expresión de AM en la  retina de animales de 15 días de edad pertenecientes a todos los grupos experimentales. Los animales del grupo CTL mostraron un aumento significativo del 152 ± 13% (p < 0,05) a los 15 días respecto a animales CTL de 7 días, con valores similares en animales HIP (Fig. 1). Los animales del grupo AP presentaron un aumento significativo del 203 ± 9% (p < 0,05) en la expresión de AM a los 15 días respecto a animales AP más jóvenes (Fig. 1). A su vez, en todos los grupos experimentales se observó que el aumento se mantuvo sostenido en el tiempo, con niveles de expresión similares desde los 15 días hasta los 30 días de edad. Sin embargo, los animales que habían sido sometidos a asfixia perinatal global severa presentaron un aumento significativo en la expresión de AM en relación a los animales CTL para cada edad evaluada. Se observó un aumento significativo en la expresión de AM en AP respecto a CTL, del 42 ± 3% (p < 0,05) a los 15 días, del 51 ± 5% (p < 0,05) a los 21 días y del 22 ± 11% (p < 0,05) a los 30 días de edad (Fig. 1). Para cada una de las edades evaluadas el tratamiento hipotérmico resultó ser efectivo para la prevención del aumento en la expresión de AM dado que los animales HIP no mostraron diferencias en los niveles de expresión para cada una de las edades estudiadas.

Fig 1. Aumento de AM en AP y reversión por hipotermia
Panel superior: Imágenes representativas del Western-Blot para el contenido de adrenomedulina a los 7, 15, 21 y 30 días de edad en animales control (CTL), hipotérmicos (HIP) y asfícticos (AP). Panel inferior: Representación de la expresión de AM estandarizada por el contenido de ß-tubulina. Se observa un aumento significativo de la expresión de AM en AP vs. CTL a los 15, 21 y 30 días. El grupo HIP no mostró cambios vs. CTL para cada edad. * Significativo para p < 0,05.
 

Mediante inmuno fluorescencia se observó la localización de AM en los procesos de las células de Müller de la capa plexiforme interna de la región interior de la retina y en la retina interna (Fig. 2). Realizando la densitometría de la expresión de AM en estudios inmunohistoquímicos se determinó un aumento significativo de la densidad óptica relativa (DOR) de AM en la retina interna (RI) de animales AP respecto a CTL, observándose un incremento del 90 ± 13% (p<0,05) a los 15 días, que se mantuvo hasta los 30 días con un valor de 112 ± 6% (p<0,05). Los animales HIP no mostraron diferencias significativas en los niveles de DOR para la expresión de AM respecto a los CTL para ninguna de las edades estudiadas. 

Fig 2. Aumento de AM en AP vs. CTL y reversión por HIP
Imágenes representativas de la expresión de AM en animales CTL, AP e HIP de 15 días (paneles superiores) y de 30 días (paneles inferiores). Se observa la inmunolocalización de AM en los procesos de las células de Müller de la capa plexiforme interna de la región interior de la retina y en la retina interna (rojo). Se muestra la localización de los núcleos celulares mediante contratinción con DAPI (azul). RI: retina interna, PI: plexiforme interna, NI: nuclear interna. Barra de escala: 30 µm.

Engrosamiento temprano de la retina interna por efecto de AP
La retina de animales que habían sido sometidos a asfixia perinatal evidenció cambios estructurales desde edades tempranas observándose un engrosamiento de su retina interna, considerándose retina interna (RI) a las capas celulares comprendidas por la capa celular ganglionar, la capa limitante interna y la capa de fibras del nervio óptico. (Fig. 3). El grosor de la capa interna de la retina de los animales del grupo AP de 15 días mostró un aumento significativo del 152 ± 10% (p<0,01) respecto al grupo CTL. Valores similares se observaron en animales de 21 y 30 días (gráfico Fig. 3).

Inducción por AP de la formación temprana de vasos en la retina interna y reversión por hipotermia
La retina interna de animales de 15 días de edad que habían sido sometidos a asfixia perinatal presentó una gran formación de neovasos, con un aumento significativo del 103 ± 11% (p<0,01) en el número de neovasos de la retina AP respecto a la vascularización presente en los CTL (Fig. 3). Dicho aumento se mantuvo en el tiempo para todas las edades evaluadas mientras que los animales HIP no mostraron diferencias respecto al CTL. En las retinas AP de 15 días se observaron 10,5 ± 1,3 vasos por campo, mientras que en los CTL e HIP se detectaron 6,4 ± 1,1 y 5,2 ± 1,0 vasos por campo respectivamente, mientras que a los 30 días se siguió observando el mismo patrón, con 9,2 ± 2,0 vasos para los AP, 4,3 ± 1,0 para el CTL y 3,6 ± 1,0 vasos para los HIP.

Fig 3. Aumento del grosor de la retina e inducción de la formación temprana de vasos en AP vs. CTL y reversión por hipotermia
Paneles superiores: Imágenes representativas de retinas CTL, AP e HIP de 15 días de edad. Se observa marcación de vasos de neoformación mediante lectina de tomate (flechas) y contratinción con violeta de cresilo, y el grosor de la retina interna mediante una barra. Panel inferior: gráfico donde se observa el aumento significativo del grosor de la retina en AP vs. CTL a partir de los 15 días y hasta los 30 días de edad. El grupo HIP no mostró cambios vs. CTL para cada edad. RI: retina interna, PI: plexiforme interna, NI: nuclear interna. Barra de escala: 30 µm.* Significativo para p < 0,05.		 Fig 4. Aumento de la expresión de GFAP en la retina de AP vs. CTL y reversión por HIP
Imágenes inmunohistoquímicas representativas de la expresión y localización de GFAP en retina de animales CTL, AP e HIP de 15 días (paneles superiores) y 30 días (paneles inferiores). Se muestra contratinción con violeta de cresilo. Se observa inmunolocalización de GFAP en limitante interna y glía perivascular (flechas), extendiéndose por los procesos internos de las células de Müller que atraviesan la plexiforme interna (cabezas de flechas), y hasta alcanzar la capa nuclear de la retina interna. El grupo HIP no mostró cambios vs. CTL para cada edad. RI: retina interna, PI: plexiforme interna, NI: nuclear interna. Barra de escala: 30 µm.

Cambios en las células de la glía inducidos por AP y reversión por HIP
La región interna de la retina de animales AP presentó un aumento en la inmunomarcación para GFAP (Figura 4), con localización en la retina interna (RI), con distribución en limitante interna y glía perivascular, extendiéndose por los procesos internos de las células de Müller que atraviesan la plexiforme interna (PI), y hasta alcanzar la capa nuclear de la retina interna (NI). El estudio por densitometría de la inmunoexpresión de GFAP en animales AP determinó un aumento significativo del 40 ± 3,4% (p<0.05) en su DOR respecto a animales CTL a los 15 días, que se mantuvo aumentada hasta los 30 días con un incremento del 42 ± 4.1 % respecto al grupo CTL (Fig. 4). Estas alteraciones no se evidenciaron en el grupo HYP respecto al CTL en ninguna de las edades evaluadas (Fig. 4).
Respecto a la microglía se observó un aumento en el número de microglías activadas en la retina de animales AP, localizadas en la capa plexiforme interna y en las cercanías de los vasos de neoformación en la retina interna (Fig. 5), los cuales no se observaron en el grupo CTL. Se determinó un aumento significativo del 33 ± 4% (p<0.05) en el número de microglías medidas sobre secciones de retina de 400 nm de largo en animales de 15 días, con presencia de 6,5 ± 1,0 microglías para AP, 4,8 ± 1,3 microglías para CTL y 3,8 ± 0,8 microglías para HIP.
Este aumento en el número de microgías activadas en retinas AP respecto a CTL creció en función del tiempo observándose un incremento del 95 ± 9% a los 21 días y del 110 ± 11% a los 30 días. Además las microglías de las retinas AP mostraron un aumento en su superficie, conformada por un incremento en la arborización de sus procesos. La expresión de microglías en animales HIP permaneció igual que el grupo CTL en todas las edades evaluadas. 

Fig 5. Aumento del número de células de la microglia en la retina de  AP vs. CTL y reversión por HIP
Imágenes representativas de la localización de células de la microglía en la retina de animales CTL, AP e HIP de 15 días reactivas para lecitina de tomate. Se presenta contratinción con violeta de cresilo. Se observa aumento del número de microglías reactivas en retina interna (cabezas de flechas) y plexiforme interna (flechas) de animales AP vs. CTL. El grupo HIP no mostró cambios vs. CTL. RI: retina interna, PI: plexiforme interna, NI: nuclear interna. Barra de escala: 10 µm.

DISCUSIÓN

La AP experimental produce lesiones neurológicas y oftalmológicas que incluyen distintos grados de IPR.16 La intensidad y duración de ésta son hechos determinantes para el desarrollo de secuelas visuales incluyendo la ROP. Por otro lado, la exposición a hiperoxia durante los cuidados neonatales intensivos en los recién nacidos prematuros, también produce una alta susceptibilidad a desarrollar la ROP. En el caso de la AP, se genera un estado de hipoxia-isquemia que daña el SNC, siendo la región más interna de la retina particularmente sensible a las variaciones del nivel de oxígeno, 11,29 lo que provoca distintos grados de retinopatía, pudiendo producir ceguera. El NO es postulado como un factor clave en la neurotoxicidad de la ROP, 11,30 y la elevación de su concentración produce efectos citotóxicos en la retina.29, 31, 32
La AP en ratas ha demostrado ser un modelo útil para estudiar la ROP, 16 ya que la inducción de hipoxia produce en el período perinatal alteraciones morfológicas, bioquímicas y moleculares características de esta afección. El desarrollo del SNC de la rata al momento del nacimiento es equivalente a las 32 semanas de gestación humanas,33 es por esto que el modelo utilizado ofrece la posibilidad de proyectar su estudio a las alteraciones en el SNC humano, incluyendo la retina, que se presentan en la prematurez.
En trabajos previos observamos a nivel estructural y ultraestructural que la AP produce vasos de neoformación e hipertrofia de las células de Müller y astroglia perivascular en las capas más internas de la retina; todos cambios típicos en la ROP.16 Se observó además, un aumento de la actividad enzimática y expresión de la NOS dependiente de la edad en retinas hipóxicas.30
En el presente trabajo hemos constatado que en los animales que sufrieron AP se engrosa el espesor de la retina interna, y esto ocurre a expensas de la respuesta glíal y la neoformación de vasos. Además los cambios ocurren a edad temprana (15 días) y en función del tiempo post-natal, sosteniéndose temporalmente en la retina interna de animales adultos que fueron sometidos a AP.
Otros trabajos demostraron que la hipoxia es el mayor estimulante de la angiogénesis, la cual se promueve vía transcripción del factor inducido por hipoxia (HIF-1).34 Las células producen constitutivamente HIF-1 β HIF 1β y en normoxia, una prolil-hidroxilasa oxida a HIF-1β estimulando su degradación, pero en hipoxia HIF-1β no es hidroxilada, entonces se transloca al núcleo, se dimeriza con HIF-1β y activa genes que contienen sitios respondedores a hipoxia como el gen de iNOS,11 de VEGF,35 y de AM.28 La AM es una hormona peptídica que fue aislada recientemente a partir de extractos de un feocromocitoma humano.27 Sus funciones más importantes son la inducción de vasodilatación, la regulación de la proliferación celular y la estimulación de la angiogénesis.28 Los principales estímulos para la secreción de AM son las citoquinas inflamatorias y la hipoxia por activación de HIF-1. En condiciones de baja presión de oxígeno (<2,0%) se observa transactivación del promotor de AM y aumento de la traducción del péptido.28 La AM es secretada por neuronas y glía,36 así como diversos tipos celulares tumorales. En la retina no están totalmente develadas las poblaciones celulares que la producen ni su rol fisiopatológico en la hipoxia-isquemia. Por esto, nuestro trabajo es novedoso en cuanto a su localización en la retina, viéndose claramente en los procesos internos de las células de Müller, contribuyendo a engrosar a la capa limitante interna. Esta observación en condiciones de hipoxia, parecería proteger inicialmente la retina mediante su actividad vasodilatadora. Este péptido aumentó su expresión e inmunomarcación en las retinas de animales sometidos a AP, a partir de los 15 días PN (post natal), en forma coincidente con la neovascularización. Nuestros resultados parecen apoyar la acción de la AM en cuanto a la protección de la retina mediante su actividad sobre la vascularización ya que el aumento en la expresión de AM coincide en el tiempo con el inicio de la neovascularización (a los 15 días PN). Es por ello que a futuro planeamos estudiar la respuesta genómica de la AM en la retina sometida a hipoxia, con el objeto de establecer en forma propicia el momento en que la AM estimula la angiogénesis, antes de que ésta se manifieste morfológicamente. La proyección de este trabajo podría ser de crucial importancia ya que permitiría establecer una ventana terapéutica en la que se podría disponer de tiempo necesario para aplicar diferentes estrategias para evitar el engrosamiento retiniano que produce la ROP.
El engrosamiento progresivo que observamos desde el día 15 PN en la capa interna de la retina se debe tanto a la angiogénesis como a una reacción glial. Esta última la hemos observado en trabajos previos tanto con microscopía óptica con inmunohistoquímica para GFAP y lectina de tomate para detectar microglía, como con microscopía. Existiría una correspondencia de GFAP con los procesos internos de los astrocitos especializados denominados células de Müller, que terminan en la capa limitante interna.16 En otro trabajo demostramos la colocalización entre GFAP e iNOS en esta zona de la retina.30 En la astroglía, la expresión de iNOS mediada por HIF-1 contribuye con la toxicidad neuronal,37 lo que podría explicar la neurodegeneración observada por nuestro grupo de trabajo en células ganglionares.16 
Con respecto a la expresión de GFAP en el tiempo, se observó una inmunomarcación positiva a partir de los 15 días PN en la capa limitante interna, propagándose a la glía perivascular de la retina interna y luego a los procesos internos de las células de Müller de la capa plexiforme interna a los 30 días PN, tal como habíamos observado en animales adultos de 60 días.16
La hipotermia demuestra una vez más ser un método eficaz para la prevención de secuelas a corto y largo plazo en el SNC de ratas sometidas a AP,18,22,24 en este caso en retina.16,30 En este trabajo se destaca su papel temprano en la prevención de las lesiones que se observan ya desde los 15 días PN. Uno de los mecanismos de acción por los cuales se explicaría el efecto neuroprotector de la hipotermia consiste en la inhibición  de las isoformas de la NOS y la nitración proteica.18 Otras estrategias terapéuticas experimentales descriptas en la bibliografía consisten en el uso de antioxidantes,38 D-penicilamina,39 alopurinol,40 indometacina,41 dexametasona,42  y rofecoxib,15 entre otros. Sin embargo, en comparación con el potente efecto protector de la hipotermia ninguno demostró ser tan eficiente para prevenir la ROP.
En conclusión, la angiogénesis aberrante y la gliosis exacerbada son características de la ROP y el tratamiento con hipotermia fue capaz de prevenir todas las alteraciones antes descriptas. Estos trabajos demuestran la existencia de una ventana terapéutica para la aplicación de hipotermia, indicando que debería ser utilizada cuanto antes luego de la noxa. En futuros experimentos se evaluará el momento ideal de intervención. La utilización de hipotermia podría ser entonces efectiva para prevenir la aparición de alteraciones vasculares y gliales a largo plazo en la retina, como las que se observan en la ROP.  

AGRADECIMIENTOS

Al Prof. José Rodrigo y Dr. Alfredo Martínez, Instituto Cajal, Madrid, España, por la donación de anticuerpos contra AM y la lectina de tomate. A la Srta. Africa Sandonis por su excelente colaboración técnica. Este trabajo ha sido subsidiado por la Universidad de Buenos Aires, Argentina, UBACyT M039.

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